Vesículas extracelulares y exosomas:de biomarcadores a herramientas terapéuticas
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Biología molecular
Las vesículas extracelulares (EVs, extracellular vesicles) son estructuras membranosas liberadas por las células que transportan una combinación de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos capaces de transmitir información entre células.
Esta capacidad de reflejar características de la célula de origen y, al mismo tiempo, modificar la función de otras células, ha despertado un enorme interés:
- Potencial diagnóstico: una de las características que hace especialmente interesantes a las EVs es su presencia en fluidos biológicos como sangre, orina o saliva, que permiten biopsias menos invasivas. Al analizar su contenido molecular se obtiene información sobre el estado fisiológico o patológico de los pacientes, lo que convierte a las EVs en una fuente muy valiosa de biomarcadores para el estudio y seguimiento de diferentes enfermedades o respuestas a tratamientos.
- Potencial terapéutico: la capacidad natural de las EVs para transportar moléculas bioactivas y mediar la comunicación intercelular las ha convertido también en candidatas para aplicaciones terapéuticas y como sistemas de delivery de fármacos. Concretamente, las EVs derivadas de células mesenquimales reciben especial atención por sus propiedades inmunomoduladoras y regenerativas y como potenciales alternativas cell-free a las terapias celulares.
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A pesar de su enorme potencial, trabajar con vesículas extracelulares presenta importantes desafíos técnicos. La heterogeneidad de tamaño, la presencia de partículas y componentes no vesiculares y la influencia de las condiciones del procesamiento pueden afectar significativamente a los resultados y la reproducibilidad de los estudios.
- Preservación: las condiciones de almacenamiento pueden modificar la concentración, el tamaño, la integridad de la membrana y el contenido molecular de las EVs, algo especialmente crítico cuando se trabaja con muestras clínicas que deben transportarse o almacenarse antes de su análisis.
- Aislamiento y enriquecimiento de las EVs: técnicas tradicionales como la ultracentrifugación son laboriosas y requieren equipamiento especializado. Aunque existen varias alternativas, ningún método de aislamiento es universal y la elección del procedimiento debe valorar el rendimiento, la pureza y las características de las vesículas recuperadas, así como la aplicación que se les va a dar.
- Aislamiento del RNA cargo: hacen falta métodos de extracción eficientes a partir de cantidades relativamente pequeñas de material biológico. Según la aplicación, es importante también que las soluciones permitan estudiar todos los tamaños de RNA (incluyendo miRNAs), sin sesgos por contenido en GC o estructuras, y que no interfieran en las aplicaciones posteriores.
- Análisis del RNA: la RT-qPCR y la NGS permiten abordar el análisis dirigido de determinados RNA o una caracterización más amplia de todas las especies contenidas, pero requieren reactivos de alta sensibilidad y soluciones especializadas en el caso del miRNA. Es imprescindible el uso de controles que permitan monitorizar la eficiencia del proceso completo y que sirvan como referencia para hacer cuantificaciones relativas.
- Escalabilidad: cuando el objetivo es producir EVs para aplicaciones terapéuticas, no es importante sólo el rendimiento, sino también que se mantengan consistentes la identidad, pureza, potencia y seguridad de las vesículas. Asimismo, es importante contar con soluciones GMP que permitan una transición ágil de la investigación a la clínica.
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Para abordar estos retos, Condalab BioSupply ofrece reactivos, servicios y equipamiento que permiten cubrir las diferentes etapas del workflow de investigación con vesículas extracelulares.
Preservación de exosomas en muestras biológicas
Las soluciones de Norgen Biotek preservan a temperatura ambiente los exosomas en sangre, orina o saliva siendo el aliado perfecto para estudios multicéntricos o muestras que deben enviarse a un laboratorio central para su posterior análisis.
Aislamiento de EVs sin ultracentrifugación
El aislamiento de exosomas usando ultracentrífuga requiere horas de trabajo. Sin embargo, el kit para aislar exosomas de Norgen permite tener exosomas aislados en 30 minutos, sin necesidad de usar ningún equipamiento complejo y sirve tanto para muestras de plasma/suero, como de saliva, orina o medio de cultivo celular.
Flujo de trabajo del Exosome Purification Kit de Norgen
Con Norgen consigues un equilibro entre rendimiento, pureza, velocidad de aislamiento de los exosomas y throughput.
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Comparación entre ultracentrífuga y Norgen
Y si lo que quieres es aislar EVs de medio de cultivo bacteriano, tenemos un kit específico y único en el mercado: Bacterial EV Isolation Kit.
Extracción de RNA y miRNA
Si lo que interesa analizar es el RNA exosomal y especialmente los miRNA, tenemos la solución perfecta: Exosomal RNA Purification Kit. Descubre sus ventajas:
- Aísla todos los tamaños de RNA de exosomas y EVs, incluyendo microRNA, sin importar el tamaño o el contenido de GC; sin sesgos.
- Compatible con exosomas que han sido aislados usando kits de Norgen, ultracentrífuga, cromatografía por exclusión de tamaño y otros métodos.
- No requiere el uso de fenol, ni de tratamiento con Proteinasa K ni tampoco de RNA Carrier.
Diferencia en la captura de Small RNA con la resina de carburo de silicio de Norgen vs las más habituales de sílice.
Si la aplicación final es RNA-seq, descubre la versión ExtraClean del kit, que permite aumentar el porcentaje de secuencias mapeadas y un mayor aprovechamiento y reducción del coste de los runs de secuenciación.
Análisis molecular
Para analizar con garantías las especies pequeñas de RNA de las vesículas extracelulares, la tecnología SMART (Switching Mechanism at the 5' end of RNA Template) es el aliado infalible. Con un input entre 1 ng y 2 ug de RNA total o ya enriquecido en smallRNA (de 15 a 150 bases), el kit SMARTer® smRNA-Seq Kit de Takara permite generar librerías secuenciables en 3h, en un único tubo.
Los adaptadores Illumina y los índices se añaden sin ligación, en el paso de amplificación por PCR, y la posterior selección de tamaño de la librería puede hacerse por perlas magnéticas o en gel.
Pasos de la preparación de librerías Illumina con el SMARTer® smRNA-Seq Kit.
Producción de EVs en células mesenquimales
Los medios de Takara/Cellartis® ofrecen un sistema completo de cultivo xeno-free para la expansión de MSC y la posterior producción de EVs, proporcionando un workflow optimizado, fácilmente escalable y extrapolable a aplicaciones clínicas.
Cellartis® MSC Xeno-Free Culture Medium (disponible +/- rojo fenol y en grado GMP) garantiza una expansión más rápida y durante más pases, sin necesidad de recubrimiento ni sueros, para una producción más económica y reproducible.
El medio es compatible con MSCs de médula ósea, tejido adiposo o cordón umbilical, y mantiene los marcadores de las mesenquimales y la capacidad de diferenciación a osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
Flujo de trabajo completo para la expansión de MSCs y posterior producción de EVs con medios Cellartis.
El subsiguiente cultivo en el medio químicamente definido Cellartis MSC EV Wonder permite obtener 9 veces más EVs que con DMEM, ofreciendo una transición suave para las células, ya que el medio basal es similar al de expansión de MSCs.
Esto garantiza un menor estrés en las células productoras para que las vesículas mantengan el perfil de expresión y funcionalidad de las células de origen, garantizando también consistencia en el tamaño medio (69 nm) y los marcadores esperados (95% dobles positivos CD9/CD81).
Consulta la nota técnica completa sobre el workflow completo de producción de EVs con MSCs.
Visualización y seguimiento de exosomas mediante marcaje fluorescente
Los kits ExoSparkler de Dojindo permiten marcar de forma sencilla los exosomas para facilitar su estudio y seguimiento. El ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit está diseñado para teñir la membrana de los exosomas, mientras que el ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit permite marcar las proteínas presentes en su interior, ofreciendo dos alternativas para su visualización en función del objetivo experimental.
Kits de marcaje de exosomas ExoSparkler
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