Legionella bajo control: Del cultivo a la qPCR

Las mejoras en la detección de Legionella han permanecido en el punto de mira, así como la optimización del manejo de los recursos hídricos y como respuesta el 2 de julio de 2024 se publicó en España un nuevo Real Decreto 614/2024 que modifica al anterior RD 487/2022.

¿Por qué es necesario un nuevo RD? 

La vigilancia de Legionella continúa siendo un reto y un parámetro importante a nivel europeo debido al continuo aumento de casos reportados en el último informe anual publicado de la ECDC con datos de 2024 se ha observado un aumento de 3.4 casos por 100 mil habitantes respecto al año anterior y 32 brotes en 8 países europeos, siendo Francia, Alemania, Italia y España los países con el 71% de los casos notificados.

Este nuevo RD es parte del marco regulatorio español y detalla algunas definiciones que no recogían ciertas situaciones o supuestos como las responsabilidades del titular de la instalación. También se especifican detalles de la toma de muestra, puntos terminales, requisitos técnicos en ciertas instalaciones prioritarias y susceptibles.

Estas modificaciones impactan y afectan tanto al Plan de Prevención y Control de Legionella (PPCL) como al Plan Sanitario frente a Legionella (PSL), dentro del marco regulatorio español, con lo cual se deberán revisar y modificar acordemente.

¿Y ha cambiado algún aspecto del control microbiológico?

El análisis de Legionella mediante el método de cultivo acorde a la ISO 11731 no ha sido modificado. Sin embargo, algunas partes del análisis si lo han hecho como la toma de muestras, que en el RD anterior en España solamente podían ser bajo la responsabilidad o por el laboratorio responsable de realizar el análisis.

Se ha establecido que este aspecto se lleve a cabo por entidades acreditadas bajo la norma ISO 17025, y para obtenerla tienen como plazo límite el 1 de enero de 2030. Este requisito y este plazo corresponden al marco regulatorio español.

Análisis de Legionella mediante medios de cultivo

La detección se realiza de acuerdo con la norma ISO 11731 y dependiendo de la naturaleza de la muestra se deben seguir ciertos pasos previos al aislamiento:

• Concentración (filtros o centrifugación)
• Dilución
• Pre-tratamiento (térmico o ácido)
• Siembra directa

En cuanto a filtros, la norma ISO recomienda una membrana de PES para la elución o de MCE si se colocan directamente sobre la placa.

Los medios de cultivo utilizados son varios, pero principalmente son el agar BCYE y el agar GVPC.

A pesar de que este es el método principal de análisis, dentro del marco regulatorio español, el procedimiento y obtención de resultado es largo y complejo, y para cepas diferentes a L. pneumophila, principal especie responsable, este método tiene una baja sensibilidad.  

Para paliar estas desventajas del método, especialmente en situaciones de urgencia, se indica el uso de técnicas moleculares. En la normativa española, se ha incluido la norma ISO 16140-2 para la validación de métodos alternativos, ya que en los últimos años la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se ha consolidado como una herramienta rápida y fiable para la detección y cuantificación de estos microorganismos en muestras de agua.

Un enfoque complementario: qPCR y cultivo

Más que plantear la qPCR y el cultivo como técnicas independientes, actualmente tiene sentido entenderlas como herramientas complementarias. La qPCR permite realizar un screening rápido de un elevado número de muestras y obtener en pocas horas información sobre la presencia y concentración de material genético de Legionella. Esto puede resultar especialmente útil en escenarios en las que es necesario tomar decisiones con rapidez, como ante la sospecha de un brote o durante una investigación epidemiológica.

Sin embargo, la qPCR detecta ADN y, por tanto, un resultado positivo no permite determinar por sí solo si las bacterias detectadas son viables. En este contexto, el cultivo continúa siendo fundamental en determinados escenarios, especialmente cuando se necesita confirmar la presencia de microorganismos viables, recuperar aislados y realizar posteriormente su identificación y caracterización microbiológica.

Por ello, ante un brote, una estrategia especialmente útil puede ser utilizar la qPCR como herramienta de cribado inicial y reservar el cultivo para la confirmación y caracterización de los resultados positivos o de aquellas muestras que, por sus características, requieran un estudio microbiológico más completo.

Este método rápido permite disponer de información en pocas horas, facilitando una toma de decisiones mucho más ágil. Además, ofrece:

• Alta sensibilidad y especificidad
• Detección y cuantificación de Legionella incluso en muestras complejas
• Mayor rapidez y simplicidad

En Condalab, contamos con kits de detección en nuestra línea Condagene^®, con los que podrás detectar y cuantificar:

• Legionella spp.
• Legionella pneumophila
• Legionella spp. & legionella pneumophila

Además de los kits de detección, contamos con los kits de extracción diseñados específicamente para muestras de agua y con el equipamiento necesario para realizar qPCR en tu laboratorio.

¿Cuál es el futuro de la qPCR para Legionella? 

Es previsible que las técnicas moleculares tengan un papel cada vez más habitual en la vigilancia y el control de Legionella. Su rapidez, capacidad para analizar un elevado número de muestras y posibilidad de obtener resultados cuantitativos las convierten en herramientas de gran interés, especialmente en situaciones que ponen en riesgo a la salud pública.

En este sentido, la norma ISO 12869, que establece requisitos para la detección y cuantificación de Legionella spp. y L. pneumophila mediante métodos basados en PCR en muestras de agua, constituye un marco metodológico que contribuye a la estandarización y aplicación de estas técnicas.

No obstante, es poco probable y viable que la qPCR sustituya completamente al cultivo. La capacidad de este último para demostrar la presencia de bacterias viables y, sobre todo, para obtener aislados que puedan caracterizarse posteriormente, sigue siendo esencial en determinados contextos.

El escenario más probable es, por tanto, una mayor integración de ambas metodologías, utilizando la qPCR de forma más rutinaria como herramienta de screening y vigilancia, y el cultivo cuando sea necesario confirmar la viabilidad del microorganismo o realizar una caracterización microbiológica y epidemiológica más profunda.