¿Conoces la alternativa a los ensayos de ChIP tradicionales? Descubre CUT&Tag.

En enero de este año presentamos el CUT&Tag-IT™ Assay Kit (ref. 53160), de nuestra compañía experta en epigenética: Active Motif. Este nuevo método CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) se utiliza para estudiar la localización genómica de modificaciones de histonas y algunos factores de transcripción que revelan interacciones entre proteínas y el DNA o identifican zonas de unión de determinadas proteínas de interés al DNA. 

Sabemos que cuando se trabaja con un nuevo método, pueden surgir muchas dudas o incluso complicaciones. Por eso, queremos ayudarte a resolver las posibles dudas que tengas sobre el CUT&Tag-IT™ Assay Kit mediante las siguientes FAQs. 

El CUT&Tag-IT™ Assay Kit, ¿incluye todo lo necesario para realizar CUT&Tag? 

Sí, el kit contiene todo lo necesario, incluyendo los transposomas pA-Tn5 ensamblados. El único material adicional que se necesita sería el material de laboratorio estándar y reactivos que aparecen en el apartado de “materiales adicionales requeridos” del protocolo. 

¿En qué se diferencia CUT&Tag de ChIP-seq? 

¿En qué casos deberíamos elegir CUT&Tag en lugar de ChIP-seq?

CUT&Tag es una gran elección para aquellos investigadores que disponen de un número de células limitado y les interesa entender cambios producidos en modificaciones de histonas por todo el genoma. Para aquellos que estén interesados en entender el reclutamiento de factores de transcripción (endógenos o con un tag) a lo largo del genoma, es más recomendable usar ChIP-seq. 

¿Con qué tipo de muestras funciona el CUT&Tag-IT™ Assay Kit? 

En estos momentos solo se dispone de protocolo para trabajar con células cultivadas. 

¿Cuántas células necesitamos para trabajar con el kit?

Se recomienda usar entre 50.000 – 100.000 células por reacción. Sin embargo, se ha logrado conseguir datos servibles de hasta una cantidad de 5.000 células. 

¿Qué controles se recomienda usar? 

Un buen control positivo para los reactivos y flujo de trabajo es el anticuerpo H3K27me3. Como control negativo, se recomienda usar el anticuerpo secundario sin el primario. Esto mostrará el ruido de fondo del anticuerpo secundario y pA-Tn5 en las muestras. 

¿Hay algún paso de QC que se recomiende? 

Tras la generación de las librerías, debería evaluarse que su calidad es óptima y se puede hacer en el TapeStation o Bioanalyzer. Una librería ideal tendría la mayoría de sus fragmentos por debajo de las 500 pb. 

¿Qué anticuerpos se han validado usando el CUT&Tag-IT™ Assay Kit? 

La lista completa de los mismos, la puedes encontrar pinchando aquí. 

¿Aquellos anticuerpos que están validados para ChIP-seq van a funcionar con CUT&Tag?

CUT&Tag y ChIP-seq tienen flujos de trabajo bastante diferentes. Que un anticuerpo funcione para ChIP-seq no quiere decir que vaya a funcionar en CUT&Tag. Es más recomendable utilizar alguno de los anticuerpos que ya ha validado Active Motif para CUT&Tag. 

¿Las librerías de CUT&Tag son single o dual-indexed?

Las librerías del CUT&Tag son dual-indexed. 

¿Las librerías de CUT&Tag contienen indentificadores moleculares (MIDs)? 

No. No los contienen. 

Las librerías generadas con el kit, ¿deberían secuenciarse como single-end o paired-end? 

Estas librerías deberían ser secuenciadas como paired-end. 

¿Qué longitud de lectura se recomienda para el CUT&Tag-IT™ Assay Kit? 

Se recomienda una longitud de lectura de 2x38 (PE38). Aunque esta longitud es más corta que aquella descrita en la publicación de Henikoff, Active Motif no han visto que esto tenga un impacto en la calidad de los datos o en la tasa de mapeo. Si se prefiere, se puede usar una longitud de lectura mayor. 

¿Cómo analizo los datos de secuenciación después de usar el kit? 

Los datos obtenidos con CUT&Tag se pueden analizar de forma similar a los de ChIP-seq. En Active Motif usan un algoritmo BWA con peak calling (método computacional para identificar áreas en el genoma que han sido enriquecidas) empleando MACS2. 

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