5 sencillos trucos que mejorarán tus reacciones de clonaje con In-Fusion Snap

TIPS: Clonaje In-Fusion 

No hay un método de clonaje en el mercado más sencillo que In-Fusion, simplemente diseña unos primers con 15 bp de solapamiento con el vector linearizado, amplifica el gen de interés y combina el inserto con el vector y la mezcla de reacción: 

No obstante, te facilitamos algunos trucos para que seas lo más eficaz posible en cada experimento y obtengas el máximo rendimiento:  

1. ¿Cuáles son las proporciones molares recomendadas de inserto-vector para el clonaje In-Fusion? 

Para garantizar resultados óptimos en condiciones estándar, o al realizar el clonaje de uno o varios fragmentos, utilizar una proporción de inserto-vector de 2:1. 

La relación molar de cada una de las múltiples inserciones debe ser de 2:1 con respecto al vector linealizado y purificado. Por ejemplo, la relación molar de dos insertos con un vector debe ser 2:2:1. 

Para calcular la cantidad necesaria de cada uno de los fragmentos de DNA, utiliza no menos de 20 ng del inserto más pequeño y calcula las cantidades del resto de los fragmentos en consecuencia, manteniendo la proporción molar de cada una de las inserciones 2:1 con respecto al vector.  

Para el clonaje de pequeños fragmentos de DNA (entre 150 y 350 pb), la relación molar sugerida entre inserto y vector es de 3 a 5:1. 

Para el clonaje de oligos sintéticos cortos (entre 50 pb y 150 pb), la relación molar sugerida de oligo- vector es de 5 a 15:1. Dependiendo de la longitud del oligo, la relación molar óptima debe determinarse empíricamente. 

Los oligonucleótidos no fosforilados son compatibles con el clonaje In-Fusion. Sin embargo, la actividad exonucleasa 3' en la mezcla de enzimas In-Fusion requiere grupos terminales 3'OH. 

Utiliza nuestra Calculadora de ratio molar online para calcular cantidades específicas de inserto-vector en función de las relaciones molares, la longitud de la inserción (pb) y la longitud del vector (pb). 

2. ¿Puedo modificar la longitud de solapamiento homólogo? ¿Una superposición más larga mejorará la eficiencia del clonaje In-Fusion? 

Las condiciones de reacción actuales de “In‑Fusion Cloning” favorecen una superposición homóloga de 15 pb para el clonaje de un solo inserto y una superposición homóloga de 20 pb para el de múltiples insertos. No recomendamos usar superposiciones de menos de 12 pb o más de 21 pb. 

3. ¿Aumentará la eficiencia del clonaje si utilizo un periodo de incubación más largo para la reacción de clonaje In-Fusion? 

No, no se recomienda aumentar el tiempo de reacción de In‑Fusion. Puede generar regiones monocatenarias desiguales en los extremos del inserto y el vector, lo que da como resultado una hibridación ineficaz de las superposiciones homólogas, lo que reduce la eficacia del clonaje. 

4. ¿Puedo utilizar células TOP10 para el clonaje In-Fusion? 

Las células TOP10 o sus derivados (p. ej., ccdB Survival 2T1R E. coli) y las cepas relacionadas (p. ej., DH10B, MC1061) son subóptimas para el clonaje In-Fusion, lo que da como resultado una menor cantidad de clones recombinantes. Esto puede ser especialmente relevante si se trata de un clonaje múltiple o si es un vector de bajo número de copias. 

Recomendamos usar Stellar Competent Cells, que están optimizadas para su uso con clonaje In Fusion. 

5. ¿Puedo emplear cantidades superiores de la mezcla de reacción In-Fusion para la transformación de las bacterias competentes? 

No recomendamos en ningún caso emplear cantidades diferentes a las indicadas en el manual de usuario.  

Transformar con una mezcla de reacción en una cantidad mayor a la indicada puede ser tóxico para sus células. Para la transformación, utiliza 2’5 µl de mezcla de reacción sin diluir ni purificar por cada 50 µl de bacterias competentes Stellar. Solo en el caso de que partas de una mayor cantidad de bacterias (100 µl), puedes escalar la cantidad de mezcla de reacción a 5 µl. 

Para conocer más acerca de nuestros kits de clonaje In-Fusion Snap, no dudes en visitar la página web de Condalab, a través de la cuál podrás además realizar el pedido online con un solo clic.