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Publicado: 14/04/21 13:39 Categorías: Biología molecular
¿Es posible que tu workflow para el COVID-19 no sea tan preciso como crees?
Al comienzo de la pandemia del COVID-19, investigadores y laboratorios se vieron en la necesidad de desarrollar kits para detectar SARS-CoV-2 en masa. Tras muchas pruebas de ensayo y error, se determinaron una serie de métodos estándar para realizar los análisis y fueron admitidos en todo el mundo. Sin embargo, ¿es posible que hubiera un método de análisis más preciso que aquellos estándares que se definieron?
Es necesario que haya soluciones para realizar pruebas masivas y descartar, de manera eficiente, falsos negativos. Sigue leyendo y conocerás que hay formas de realizar pruebas de COVID-19 más precisas.
Falsos negativos para COVID-19.
Los falsos negativos son uno de los grandes retos que los investigadores y clínicos se encuentran con los métodos estándar actuales para la extracción del RNA viral del SARS-CoV-2.
Cuando se toma una muestra, bien mediante una torunda nasofaríngea u otro método de recolección de muestras, ésta se conserva en un Medio de Transporte de Virus (o VTM, según sus siglas en inglés) o en un Medio Universal de Transporte (UTM, según sus siglas en inglés). Aquí es donde comienza el desafío. Estos medios, a menudo, fallan a la hora de preservar el RNA viral de manera eficiente, ya que solo estabilizan el RNA viral de muestras clínicas un máximo de 3 días, a temperatura ambiente. Esto lleva a una rápida degradación/fragmentación del RNA viral. Además, tanto los VTM como UTM no convierten a la muestra en no infecciosa para un manejo más seguro.
¿Por qué es importante que el RNA esté o no fragmentado?
El método estándar actual para la extracción de RNA (tecnología basada en perlas magnéticas de sílice) no es capaz de capturar, de manera eficiente, RNA que está altamente fragmentado. Esto se debe al sesgo que tiene la tecnología basada en sílice en tender a capturar los fragmentos de RNA más largos. Si no se captura completamente el RNA viral fragmentado, la probabilidad de que se produzca un falso negativo en los resultados de los análisis del COVID-19 usando la técnica RT-qPCR, es significativamente mayor.
Estudio comparativo de métodos de extracción de RNA para el COVID-19.
Esta inconsistencia con los métodos de extracción de RNA viral estandarizados en los workflow del COVID-19 llevó al equipo de Norgen Biotek a realizar un estudio en el cual se comparaba su método de extracción frente a la tecnología basada en perlas magnéticas de sílice. Su objetivo era determinar si existía alguna diferencia en los métodos de extracción de RNA en cuanto a cuál de ellos tenía la mayor sensibilidad para capturar RNA viral fragmentado del SARS-CoV-2.
Para ello, el laboratorio de referencia Boca Biolistics (Florida, Estados Unidos) suministró a Norgen 44 muestras clínicas nasofaríngeas tomadas con una torunda. Utilizando el kit PerkinElmer® SARS-CoV-2 Real-time RT-PCR Assay (aprobado por la FDA para uso de emergencia, EUA), se confirmó que todas ellas eran positivas para SARS-CoV-2.
¿Sílice o carburo de silicio?
Se investigó la eficiencia de dos métodos de extracción de RNA en cuanto a su precisión para detectar RNA viral del SARS-CoV-2 en las 44 muestras clínicas que hemos mencionado previamente.
El primero fue el método más común para extraer RNA viral: la tecnología tradicional basada en perlas magnéticas de sílice. Se utilizó el kit Quick-DNA/RNA Viral MagBead de la compañía Zymo Research.
El segundo método de extracción se basa en el uso de carburo de silicio. Se utilizó el Saliva/Swab RNA Purification Kit de Norgen.
¿Cuál es la mejor tecnología para la purificación del RNA?
Se extrajo el RNA utilizando ambos métodos y, posteriormente, se realizó un ensayo de RT-qPCR utilizando el 2019-nCoV TaqMan RT-PCR Kit (ref. TM67100) de Norgen para 3 genes target (N1, N2 y RP), tal y como recomienda el CDC.
Cuando se compararon los datos de la RT-qPCR, tras haber usado el kit de Zymo y el de Norgen, se pudo comprobar que el método de extracción basado en perlas magnéticas de sílice resultaba en una tasa de un 25% de falsos negativos para muestras que realmente eran positivas en SARS-CoV-2. Asimismo, el método de extracción basado en carburo de silicio daba lugar a una tasa de 100% verdaderos positivos para las muestras del SARS-CoV-2 y tenía valores de Cts más consistentes en comparación con el otro método.
Estos resultados ponen de manifiesto que se podrían evitar resultados de falsos negativos utilizando la tecnología de carburo de silicio de Norgen en lugar de la tradicional basada en sílice.
¿Por qué no habías escuchado antes hablar de la extracción de RNA basada en carburo de silicio?
Se trata de una tecnología que ha sido patentada por Norgen para la extracción del RNA y que muestra una mayor afinidad de unión al RNA que otras, especialmente, para pequeños fragmentos de RNA muy degradados, como es el RNA viral. El carburo de silicio tiene una afinidad de unión uniforme a todas las secuencias del RNA, sin que se produzca ningún sesgo en función del contenido en GC o tamaño. Además, esta tecnología no requiere el uso de ningún RNA carrier o productos químicos dañinos como el fenol/cloroformo.
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